(21), (22) Заявка: 2011116693/15, 28.04.2011
(24) Дата начала отсчета срока действия патента:
28.04.2011
Приоритет(ы):
(22) Дата подачи заявки: 28.04.2011
(43) Дата публикации заявки: 10.11.2012
(56) Список документов, цитированных в отчете опоиске:
RU 2249212 С1, 27.03.2005. RU 2304783 С1, 20.08.2007. KR 1020100088217 А, 09.08.2010.
Адрес для переписки:
603005, г.Нижний Новгород, ул. Алексеевская, 1, Учебно-лабораторный корпус ГОУ ВПО НижГМА, патентно-лицензионный отдел, зав. отделом Е.К. Павловой
(72) Автор(ы):
Лапина Владлена Георгиевна (RU),Качалина Татьяна Симоновна (RU),Каткова Надежда Юрьевна (RU)
(73) Патентообладатель(и):
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Нижегородская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГОУ ВПО НижГМА Минздравсоцразвития России) (RU)
(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ГЕСТОЗА У БЕРЕМЕННЫХ
(57) Реферат:
Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования возникновения гестоза у беременных женщин. Способ включает определение содержания неоптерина в сыворотке крови в сроки 16-18 недель гестации. Возникновение гестоза прогнозируют при уровне неоптерина выше 8,1 нмоль/л. Способ позволяет достоверно выявлять начальные изменения в организме женщины еще до клинических проявлений заболевания, позволяет более объективно оценить риск развития заболевания. 2 ил., 1 табл., 1 пр. 
Предлагаемое изобретение относится к исследованию биологических жидкостей физическими и химическими методами исследования и может быть использовано в медицине, а именно в акушерстве, для прогнозирования возникновения гестоза у беременных женщин.
Гестоз - не самостоятельное заболевание, это синдром, обусловленный невозможностью адаптационных систем организма матери адекватно обеспечить потребности развивающегося плода.
Гестоз встречается у 6-8% беременных в развитых странах, превышает 20% в развивающихся (Айламазян Э.К. Гестоз: теория и практика. М.: МЕДпресс-информ, 2008; с.7) и до настоящего времени остается одним из самых тяжелых осложнений беременности. По данным отечественных авторов, гестоз занимает третье место в структуре материнской летальности. В последние годы частота данной патологии не только не имеет тенденции к снижению, но и неуклонно растет и составляет, по данным различных авторов, от 7 до 25% от числа родов (Robillard P.Y. Interest in preeclampsia for researches in production. J Reprod Immunol 2002; 53 (1-2): 279-287).
Увеличению частоты данной патологии в популяции женщин репродуктивного возраста способствует рост экстрагенитальных заболеваний, среди которых основными являются следующие: заболевания почек, эндокринопатии, сердечно-сосудистые заболевания, сахарный диабет, анемии, аутоиммунные заболевания, генетические формы тромбофилий (Венцковский Б.М. Гестозы: руководство для врачей. М., 2005, с.25).
В этой связи чрезвычайно актуальными остаются проблема донозологической диагностики гестоза и поиск маркеров для раннего распознавания и мониторинга данной патологии беременности. Учитывая все вышеизложенное, предлагаемое изобретение является актуальным.
Выявление маркеров развития гестоза ведется в различных направлениях. На сегодняшний день протестировано более 100 методов ранней диагностики и прогнозирования данного осложнения беременности, однако до сих пор отсутствует достаточно надежный и чувствительный метод доклинического распознавания гестоза.
Известен способ прогнозирования гестоза, включающий определение концентрации антител к нейроспецифической енолазе (NSE) и глиофибриллярно-кислому протеину (GFAP) (анти-NSE-антител и анти-CFAP-антител) в сыворотке крови беременных. Развитие гестоза прогнозируют при уровне анти-NSE-антител более 0,6 мкг/мл или анти-CFAP-антител более 0,9 мкг/мл (патент RU 2287823 C1, G01N 33/53, выдан в 2006, опубл. 20.11.2006).
Известен способ прогнозирования гестоза заключающийся в том, что в ранние сроки (с 5 недель) в плазме крови беременной определяют уровень карбонильных производных белков и при величине, равной 51,7 ед. оптической плотности/г белка и выше, прогнозируют развитие гестоза (RU 2249212 C1, G01N 33/48, выдан в 2005, опубл. 27.03.2005).
Недостатками указанных способов являются: 1) в изобретениях не указан точный срок беременности, в котором необходимо производить анализ, а те сроки, которые рассматриваются в примерах, слишком размыты; 2) в первом изобретении развитие гестоза прогнозируется при изменении одного из двух маркеров, а это достаточно дорого и трудоемко.
За прототип предлагаемого изобретения выбран известный способ прогнозирования возникновения гестоза у беременных, включающий исследование сыворотки крови иммуноферментным анализом в сроке 16-18 недель и определение содержания антител к катепсину G (Лапина В.Г., Качалина Т.С., Каткова Н.Ю. Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения 2010; 148 (III): 95-96).
Известный способ осуществляют следующим образом: в сыворотке крови беременных женщин в сроке 16-18 недель гестации определяют содержание антител к катепсину G с использованием иммуноферментного анализа (ИФА). Возникновение гестоза прогнозируют при уровне показателя - 1,3±0,7 Ед/мл.
Однако данный метод обладает недостаточной чувствительностью - 75%.
Задачей предлагаемого изобретения является повышение чувствительности и специфичности прогнозирования гестоза.
Поставленная задача решается тем, что в известном способе прогнозирования возникновения гестоза у беременных, включающем исследование сыворотки крови иммуноферментным методом в сроки 16-18 недель и определение содержания антител к катепсину G, определяют содержание неоптерина иммуноферментным анализом и возникновение гестоза прогнозируют при уровне неоптерина выше 8,1 нмоль/л, при норме 4,30-8,10 нмоль/л.
Предлагаемое изобретение отвечает критерию изобретения «новизна», так как проведенные патентно-информационные исследования не выявили источников патентной и научно-технической литературы, которые бы порочили новизну предлагаемого способа.
Предлагаемое изобретение отвечает критерию изобретения «изобретательский уровень», так как при проведении патентно-информационных исследований не обнаружено технических решений с существенными признаками предлагаемого способа.
Основным источником НП являются клетки крови. Его концентрация в крови отражает совместное действие различных цитокинов на популяцию моноцитов/макрофагов, стимулированных IFN 
. НП является интегральным маркером индукции клеточного иммунитета, поэтому его определение особенно важно при инфекционных заболеваниях, хронических воспалительных процессах, сопровождающихся активацией иммунной системы (Шевченко О.П., Олефиренко Г.А., Орлова О.В. Неоптерин. М.: Реафарм, 2003; с.64). В акушерстве и гинекологии неоптерин используется как критерий прогнозирования развития плацентарной недостаточности у беременных группы высокого риска по внутриутробному инфицированию плода (Андосова Л.Д. Патогенетические аспекты плацентарной недостаточности при инфекции. Автореф. канд. дисс. Н.Н., 2006), а так же для диагностики угрозы прерывания беременности (Стояненко О.О. Роль неоптерина и провоспалительных цитокинов в диагностике угрозы прерывания беременности в ранние сроки. Автореф. канд. дисс. М., 2006).
Для подтверждения получаемого положительного эффекта авторы провели обследование беременных в сроке 16-18 недель гестации путем определения в сыворотке крови концентраций антител к катепсину G и неоптерина.
В исследование включено 120 беременных в сроках от 16-18 недель гестации до родов:
1) основная группа - пациентки, у которых развился гестоз легкой или средней степени тяжести, n=68;
2) контрольная группа - женщины, беременность которых не осложнилась гестозом, n=52.
На каждую женщину заполнялась «Карта обследования», в которую вносились данные анамнеза, сведения о тактике ведения больных и исходах заболеваний. Комплексное обследование беременных проводилось в I, II, III триместрах с использованием общеклинических, лабораторных, инструментальных методов. Результаты методов объективного исследования сопоставлялись с анамнестическими данными и показателями клинического обследования беременных. Состояние плода и фетоплацентарного комплекса оценивались при помощи УЗИ и допплерометрии.
Изучение концентрации антител к катепсину G и неоптерина проводилось в сыворотке крови у беременных женщин в сроки 16-18 недель (таблица 1, фиг.1, 2).
Проведенные исследования показали, что уровень неоптерина в сыворотке крови женщин контрольной группы составил 6,20±1,90 нмоль/л. У пациенток же основной группы концентрация НП была в пределах 12,61±4,48 нмоль/л, что в 2 раза выше в сравнении с контрольной (р<0,0001).
Что касается антител к катепсину G, то в основной группе этот показатель составил 1,32±0,61 Ед/мл, что достоверно ниже, чем у женщин контрольной группы - 1,71±0,37 Ед/мл (р<0,005).
Нами установлено, что при уровнях неоптерина, превышающих значение 8,1 нмоль/л, развитие гестоза прогнозируется в 77,6% случаев, а при уровнях антител к катепсину G ниже 1,4 Ед/мл - в 74,6%. Повышенные концентрации неоптерина в сочетании с низким содержанием антител к катепсину G в сыворотке крови отмечаются в 69% случаев.
Кроме того, между концентрациями неоптерина и антителами к катепсину G в основной группе женщин установлена значимая отрицательная корреляционная связь (r=-0,55, р=0,000001). Это свидетельствует о том, что из этой пары показателей с ростом одного другой снижается или, находясь под воздействием некоего третьего фактора, эти показатели изменяются разнонаправлено. Следовательно, мы имеем возможность определять лишь один из указанных маркеров для прогнозирования возникновения гестоза, а это существенно сокращает материальные затраты лечебных учреждений.
Таблица 1 Уровень провоспалительных протеинов в сыворотке крови беременных в сроке 16-18 недель гестации Исследуемый показатель Основная группа Контрольная группа Неоптерин, нмоль/л 12,61±4,48** 6,20±1,90 Антитела к катепсину G, Ед/мл 1,32±0,61* 1,71±0,37 Примечание: * - достоверность различия показателя между группами, р<0,005; ** - достоверность различия показателя между группами, р<0,0001.
Содержание неоптерина в крови у пациенток с развившимся гестозом было достоверно выше, а антител к катепсину G - ниже, чем в группе женщин с неосложненной гестозом беременностью, что определяет данные показатели как маркеры прогнозирования развития гестоза. При концентрации неоптерина в сыворотке крови у беременных в сроки 16-18 недель более 8,1 нмоль/л и антител к катепсину G менее 1,4 Ед/мл возможно прогнозирование развития гестоза.
Предлагаемый способ позволяет получить при использовании следующий технический эффект: чувствительность - 77%; специфичность - 97%.
Предлагаемый способ прогнозирования гестоза позволяет выявлять начальные изменения в организме женщины еще до клинических проявлений заболевания. Разработанный автором подход по исследованию содержания неоптерина может быть использован для определения групп риска по возникновению гестоза.
Результаты работы могут быть использованы в деятельности женских консультаций, акушерских стационаров, гинекологических и лабораторных отделений, диагностических центров. Внедрение разработанного метода прогнозирования гестоза дает возможность более объективно оценить риск развития заболевания, своевременно провести лечебно-профилактические мероприятия, что, в конечном итоге, будет благоприятно влиять на перинатальные исходы и снижение заболеваемости новорожденных.
Способ осуществляют следующим образом: в сыворотке крови беременных женщин в сроке 16-18 недель гестации определяют содержание антител к катепсину G и неоптерина с использованием ИФА тест-систем ELISA фирмы IBL (Гамбург).
Количественное определение антител к катепсину G методом иммуноферментного анализа. Исходным материалом для определения катепсина G методом иммуноферментного анализа является сыворотка крови. Анализ проводится в микропланшете, покрытом особо чистым препаратом катепсина G. Присутствующие в образцах антитела к катепсину G связываются с иммобилизованным в микроячейках антигеном. При промывке удаляют несвязавшиеся компоненты сыворотки. Конъюгат антител к IgG человека с пероксидазой хрена добавляется в ячейки и иммунологически связывается с аутоантителами из сывороток ORGENTEC Anti-Cathepsin G ELISA, ORG 525 пациентов, связанных с иммобилизованными антигенами, в результате чего образуется комплекс конъюгат/антитело/антиген. Избыток ферментного конъюгата удаляется при следующей промывке. Раствор хромогенного субстрата в присутствии связавшегося конъюгата гидролизуется с образованием голубого окрашивания. Развитие окраски останавливается добавлением кислого стоп-раствора, при этом окрашивание меняется на желтое. Интенсивность этого окрашивания определяют фотометрически при 450 нм. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации аутоантител IgG к катепсину G в образце.
Количественное определение неоптерина методом иммуноферментного анализа. В качестве исходного материала для определения НП методом иммуноферментного анализа используют сыворотку или плазму крови. Принцип метода количественного определения неоптерина заключается в следующем: антиген, конъюгированный с пероксидазой, и неконъюгированный антиген конкурируют между собой за ограниченное число мест связывания при взаимодействии с антителами кролика к неоптерину человека. Комплекс пероксидаза - конъюгированный антиген-антитело связывается с поверхностью лунок на стрипе для микротитрования, покрытых антителами козы к антителам кролика. Несвязавшийся антиген удаляется из лунок на стадии промывания. После проведения ферментативной реакции со специфическим субстратом, в лунках измеряют поглощение при 450 нм. Количество комплексов, связавшихся с поверхностью микролунок, и оптическая плотность обратно пропорциональны концентрации неоптерина в исследуемом образце. Количественное определение проводят путем сравнения ферментативной активности в исследуемом образце с кривой, полученной при анализе стандартов с известными концентрациями.
Примеры конкретного исполнения даны в виде выписок из историй болезни.
Пациентка А., 24 года. Срок беременности 16 недель.
Проведено количественное определение в сыворотке крови провоспалительных протеинов:
неоптерин - 4,7 нмоль/л (N 4,30-8,10);
антитела к катепсину G - 1,7 Ед/мл (N 1,40-2,50).
Особенности течения беременности: анемия.
Роды своевременные доношенным плодом, без осложнений.
Пациентка А., 24 года. Срок беременности 17 недель.
Проведено количественное определение в сыворотке крови провоспалительных протеинов:
неоптерин - 11,5 нмоль/л (N 4,30-8,10);
антитела к катепсину G - 1,1 Ед/мл (N 1,40-2,50).
Особенности течения беременности: гестоз легкой степени в сроке 38 недель (отеки+протеинурия). Стационарное лечение в палате беременных.
Роды своевременные доношенным плодом, без осложнений.
На клиническом примере показана целесообразность определения неоптерина в сыворотке крови беременных женщин в начале второго триместра гестации, что дает возможность прогнозировать гестоз.
Формула изобретения
Способ прогнозирования возникновения гестоза у беременных, включающий исследование сыворотки крови иммуноферментным анализом в сроки 16-18 недель гестации, отличающийся тем, что определяют содержание неоптерина и возникновение гестоза прогнозируют при уровне неоптерина выше 8,1 нмоль/л.
РИСУНКИ
